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ABOUT LAMP
RTLAMP > Über LAMP
Die Grundlagen
Was zum Kuckuck ist LAMP?
LAMP steht für „loop-mediated isothermal amplification reaction“. Ganz schöner Zungenbrecher, bezeichnet aber eigentlich nur eine biochemische Reaktion zur Vervielfachung von DNA, eine Gemeinsamkeit mit der herkömmlichen PCR. Methodisch unterscheiden sich die beiden Reaktionen aber. Die LAMP-Reaktion beinhaltet die Bildung eines molekularen „loops“ (Schleife). Die Amplifikation beginnt sobald dieser loop gebildet ist, und erfolgt sehr viel schneller als bei der PCR, und produziert außerdem wesentlich mehr DNA. Aus diesem Grund wird LAMP manchmal als „explosive“ Amplifikationsreaktion bezeichnet.
Wie kann LAMP für diagnostische Zwecke nützlich sein?
Die DNA-Amplifikation ist spezifisch. Sie kann nur starten, wenn das Reaktionsgemisch kurze DNA-Sequenzen enthält, die mit der DNA der Probe übereinstimmen. Diese kurzen DNA-Stücke, auch „Primer“ genannt, werden so entworfen, dass sie dem SARS-CoV-2-Virus entsprechen. Dadurch kann die Reaktion nur dann starten, wenn Viruspartikel in der Probe enthalten sind. Somit erfährt man, ob die Probe einer bestimmten Person das Virus enthält – und ein Doktor kann mit dieser Information nun die Diagnose Covid-19 aussprechen.
Was bedeutet RT?
Bis jetzt haben wir über DNA geredet. Aber vielleicht wisst ihr, dass SARS-CoV-2 ein RNA-Virus ist. Das bedeutet, dass RNA der Träger der genetischen Information ist. Obwohl dies der Fall ist können wir mithilfe eines weiteren Schrittes damit arbeiten, als wäre es DNA. Dieser Schritt heißt Reverse Transkription (RT). Einfach gesagt eine Umwandlung von RNA in DNA, welche von einem Enzym namens Reverse Transkriptase katalysiert wird. Dadurch ist man mit RT-LAMP in der Lage RNA in einer Probe zu detektieren, obwohl man eigentlich DNA amplifiziert um das Ergebnis zu erhalten.
Wie weiß man, ob eine Reaktion positiv ist?
Wie wir gerade gelernt haben ist RT-LAMP eine Reaktion, die zu DNA-Vervielfältigung führt, falls eine spezifische RNA-Sequenz in der Probe vorhanden ist. Aber wie kann man beurteilen, ob diese Reaktion überhaupt stattgefunden hat? LAMP führt zu einer so massiven Vervielfältigung von DNA, dass diese die chemische Balance der Reaktionslösung durch die Bildung bestimmter Nebenprodukte rapide verändert. Die Veränderung der Menge dieser Nebenprodukte führt zum Farbumschlag bestimmter Farbstoffe, die wir daher als Indikatoren für den erfolgreichen Reaktionsablauf nutzen und die Reaktion mit bloßem Auge verfolgen können!
virale RNA
violetter Reaktionsmix
blaues positives Ergebnis
SARS-CoV-2 nachgewiesen
virale RNA
violetter Reaktionsmix
violettes negatives Ergebnis
kein SARS-CoV-2 nachgewiesen
Unsere LAMPs im Porträt
Zwei verschiedene Reaktionstypen
RT-LAMP
Den Reaktionsmix zusammenstellen, die inaktivierte Probe zugeben, für 30 Minuten bei 63°C inkubieren.
Einfach, schnell, günstig.
RT-LAMP
Innerhalb von 40 Minuten von der Probennahme zum Ergebnis. Minimale Bearbeitungszeit im Labor. Sichere Diagnosestellung bei allen Proben von infektiösen Personen. Farbumschlag von Violett nach Blau.
bead-LAMP
Die Proben-RNA aufreinigen und -konzentrieren mittels magentischer Partikel ("Beads"), dann die LAMP-Reaktion starten. Überlegene Sensitivität.
bead-LAMP
Innerhalb von 50 Minuten von der Probennahme zum Ergebnis. Beinhaltet einen 15-minütigen Bead-Aufreinigungsschritt zur Konzentration der viralen RNA. Identifiziert positive Proben sogar bei sehr geringer enthaltener Virusmenge. Farbumschlag von Rot nach Gelb.
Massiver Sensitivitätsgewinn durch bead-LAMP
Ein schneller, einfacher und relativ günstiger Konzentrationsschritt mit magnetischen Beads erlaubt es, ein Vielfaches des herkömmlichen Probenvolumens in der Reaktion einzusetzen. Dadurch kann die LAMP-Reaktion selbst schwach positive Proben identifizieren, die mit gewöhnlichen LAMP- oder Antigenschnelltests nicht nachweisbar wären. Bead-LAMP erreicht somit den Sensitivitätsbereich der Goldstandard-PCR-Tests.
Einsatz verschiedener Probenmedien möglich
Manche RT-LAMP-Reaktionen funktionieren nur mit extrahierter RNA – unser LAMP kann mehr. Die Methode ist kompatibel mit vielen verschiedenen Probentypen und kommt ohne RNA-Extraktion aus. Unsere Protokolle funktionieren mit Abstrichproben (in vielen gängigen Probenaufnahmemedien), mit Spucke und Gurgelat. Gurgeln bietet dabei die optimale Kombination aus Einfachheit und Komfort in der Anwendung bei gleichzeitiger ausreichender Sicherheit und Sensitivität. Nach Entnahme werden die Proben durch eine sehr kurze Inkubation bei 95°C in Anwesenheit einer speziellen Pufferlösung inaktiviert. Das Virus wird hierbei zerstört, aber die virale RNA wird erhalten. Dabei sollte beachtet werden, dass direkt inaktivierende Transportmedien grundsätzlich mit RT-LAMP inkompatibel sind, weil enthaltene aggressive Chemikalien die Reaktion inhibieren.
Eindeutiger Farbumschlag
Unsere Protokolle basieren auf dem visuellen Nachweis zweier verschiedener Nebenprodukte der DNA-Amplifikation. Für RT-LAMP nutzen wir den Indikatorfarbstoff Hydroxynaphtholblau, der durch ein Absinken der Konzentration an freiem Magnesium einen Farbumschlag von Violett nach Himmelblau erfährt. Für bead-LAMP verwenden wir Phenolrot, einen pH-abhängigen Farbstoff, dessen Farbumschlag von Rot nach Gelb durch ein Absinken des pH-Werts durch die DNA-Amplifikation verursacht wird. Diesen Farbstoff können bei herkömmlichem RT-LAMP nicht benutzen, das die Reaktion dadurch mit einigen Probenmedien inkompatibel sein würde. Bei bead-LAMP hingegen sorgt der Bead-Aufreinigungsschritt dafür, dass wir pH-modifizierende Probenmedien entfernen, und können Phenolrot somit verwenden.
Hochgradig sensitiv und spezifisch
Unsere RT-LAMP-Reaktionen sind für minimale Falschpositivrate und maximale Sensitivität optimiert. Weitere Informationen zu Sensitivität und Spezifität können in unserem <a href=“https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.23.166397v2″>bioRxiv-Manuskript</a> gefunden werden.
Open-Access-Konzept schützt RT-LAMP vor Lieferengpässen
Ein perfekter Test ist völlig nutzlos, wenn er nicht im großen Stil eingesetzt werden kann. Darum spielt die Verfügbarkeit der einzelnen Komponenten eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung unserer LAMP-Assays. Unsere Protokolle sind öffentlich zugänglich und werden auf unserer Website ständig aktualisiert, und wir haben Open-Access-Protokolle auf Basis der Wildtypenzyme BstLF und HIV-RT, die nicht durch Patente geschützt werden, entwickelt. So können die Enzyme weltweit genutzt werden, ohne das eine Erlaubnis eingeholt oder Lizenzgebühren gezahlt werden müssen. Nur so können etwaige Lieferengpässe vermieden werden, die seit Beginn der Pandemie Massentestungen erschwert haben. Alles ist öffentlich und jedermann kann es herstellen – Versorgungslücken adé!
Unsere Protokolle im Überblick
Wir stellen Protokolle für RT-LAMP und bead-LAMP zur Verfügung. Jeder Nutzer kann entscheiden, ob er den Großteil der Reagenzien und Enzyme kaufen möchte, oder Enzyme und/oder Puffer selbst herstellen möchte. Für beide Varianten bieten wir auf dieser Seite Protokolle an.
KOMMERZIELLE PROTOKOLLE
- nutzen im Handel erhältliche Reagenzien
- geringster initialer Aufwand
- qualitätsgeprüfte Produktchargen
- höherer Preis pro Reaktion
- anfälliger für Versorgungsengpässe
Open-Access-Protokolle
- nutzen selbst exprimierte/aufgereinigte Enzyme
- mehr initialer Aufwand
- Chargen müssen selbst getestet werden
- sehr geringer Preis pro Reaktion
- nicht anfällig für Versorgungsengpässe
Günstig
Ein Test zum Preis einer Tasse Kaffee
Weniger als ein Euro pro RT-LAMP-Reaktion. Dieser niedrige Preis ermöglicht flächendeckendes, schnelles Testen überall auf der Welt.
Visuell
Visuelles Auslesen mittels Farbumschlag
Ein einfacher, mit bloßem Auge sichtbarer Farbumschlag zeigt die Anwesenheit von SARS-CoV-2-Molekülen an.
Einfach
Low-Tech-Protokoll
Virusnachweis ohne RNA-Extraktion, Thermocycler oder Fluoreszenz: RT-LAMP läuft bei konstant 63°C in Inkubatoren, Thermoblocks oder sogar Wasserbädern!
Schnell
Von der Probennahme zum Ergebnis in unter 40 Minuten
Virusnachweis ohne RNA-Extraktion, Thermocycler oder Fluoreszenz: RT-LAMP läuft bei konstant 63°C in Inkubatoren, Thermoblocks oder sogar Wasserbädern!
Open Access
Technologien für jedermann
Wie wollten einen Test entwickeln, den jeder durchführen kann. Unsere Open-Access-Protokolle und -Enzyme kann jedes molekularbiologische Labor kostengünstig selbst nutzen und herstellen und umgeht damit Großhändler, das Resultat: unglaublich geringe Kosten pro Reaktion. Pufferzusammensetzungen sind öffentlich und nicht geschützt.
Selbstständiges Testen
Einfache, bequeme Probennahme
Gurgeln ist eine effektive, komfortable und verlässliche Probennahmemethode für SARS-CoV-2-Tests. Der Arbeitsaufwand für medizinisches Personal wird außerdem gesenkt, indem diese eigenständig durchführbare Methode der Probennahme gewählt wird.
Skalierbarkeit
kompatibel mit Hochdurchsatz und gleichzeitig flexibel
RT-LAMP kann zu Hause mit einer Handvoll Laborplastik und Pipetten, oder in klinischem Hochdurchsatzumfeld mit automatisierten Abläufen durchgeführt werden. Skalierbarkeit ist ein kritischer Punkt, wenn man einen Unterschied machen will. Unsere Methode kann einfach automatisiert und hochskaliert werden, um im hochtechnisierten Klinikalltag zu bestehen.
Flexibilität
Mit verschiedenen Probentypen kompatibel
Egal ob Abstrichproben in Viral Transport Medium/Universal Transport Medium/Kochsalzlösung oder Gurgelat in HBSS/Kochsalzlösung/Wasser, RT-LAMP und vor allem bead-LAMP sind mit vielen verschiedenen Probenmedien kompatibel.
Sicher
Prävention von Kreuzkontamination
LAMP ist grundsätzlich recht anfällig für Kontamination. Wir haben ein bereits bekanntes System zur Kontaminationsprävention, basierend auf dUTPs und thermolabilem UDG-Enzym, implementiert. Damit wird sichergestellt, dass die Falschpositivrate und der Arbeitsaufwand im Labor minimal gehalten werden.
LAMP vs PCR vs Antigentest
Um einer schweren Pandemie zu begegnen, braucht es diverse Ansätze. Wir behaupten nicht, dass LAMP in allen Szenarien am besten ist, und um die Verbreitung des Virus zu stoppen ist sicherlich eine komplexe Strategie mit allen gängigen Testmethoden nötig. Hier präsentieren wir eine übersichtliche Aufstellung dieser verschiedenen Technologien, wie sie funktionieren und was sie unterscheidet.
PCR
Was nachgewiesen wird
Virale RNA
Wie es funktioniert
DNA-Amplifikation wird in Echtzeit mittels Fluoreszenz visualisiert.
Wo es angewendet wird
Diagnostische Labore
Sensitivität
Sehr hoch
Kosten
Hoch
Probentyp
Bevorzugt Abstrichproben oder extrahierte RNA
Bearbeitungszeit
2-4 Stunden
LAMP
Was nachgewiesen wird
Virale RNA
WIe es funktioniert
DNA-Amplifikation wird durch Farbumschlag der Reaktionslösung angezeigt.
Wo es angewendet wird
Diagnostische Labore, Arztpraxen, zu Hause
Sensitivität
Mittel bis hoch
Kosten
Niedrig
Probentyp
Gurgelat, Abstriche, Spucke, keine RNA-Extraktion notwendig
Bearbeitungszeit
30-45 Minuten
Antigentest
Was nachgewiesen wird
Oberflächenproteine der Viruspartikel
WIe es funktioniert
Die Bindung eines Antikörpers an ein Oberflächenprotein auf der Virushülle wird auf einem Teststreifen (Lateral Flow Strip) visualisiert.
Wo es angewendet wird
Diagnostische Labore, Arztpraxen, zu Hause.
Sensitivität
Niedrig bis mittel
Kosten
Niedrig bis mittel
Probentyp
Abstrichprobe
Bearbeitungszeit
5-30 Minuten