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Die Grundlagen

Was zum Kuckuck ist LAMP?

LAMP steht für „loop-mediated isothermal amplification reaction“. Ganz schöner Zungenbrecher, bezeichnet aber eigentlich nur eine biochemische Reaktion zur Vervielfachung von DNA, eine Gemeinsamkeit mit der herkömmlichen PCR. Methodisch unterscheiden sich die beiden Reaktionen aber. Die LAMP-Reaktion beinhaltet die Bildung eines molekularen „loops“ (Schleife). Die Amplifikation beginnt sobald dieser loop gebildet ist, und erfolgt sehr viel schneller als bei der PCR, und produziert außerdem wesentlich mehr DNA. Aus diesem Grund wird LAMP manchmal als „explosive“ Amplifikationsreaktion bezeichnet.

Wie kann LAMP für diagnostische Zwecke nützlich sein?

Die DNA-Amplifikation ist spezifisch. Sie kann nur starten, wenn das Reaktionsgemisch kurze DNA-Sequenzen enthält, die mit der DNA der Probe übereinstimmen. Diese kurzen DNA-Stücke, auch „Primer“ genannt, werden so entworfen, dass sie dem SARS-CoV-2-Virus entsprechen. Dadurch kann die Reaktion nur dann starten, wenn Viruspartikel in der Probe enthalten sind. Somit erfährt man, ob die Probe einer bestimmten Person das Virus enthält – und ein Doktor kann mit dieser Information nun die Diagnose Covid-19 aussprechen.

Was bedeutet RT?

Bis jetzt haben wir über DNA geredet. Aber vielleicht wisst ihr, dass SARS-CoV-2 ein RNA-Virus ist. Das bedeutet,  dass RNA der Träger der genetischen Information ist. Obwohl dies der Fall ist können wir mithilfe eines weiteren Schrittes damit arbeiten, als wäre es DNA. Dieser Schritt heißt Reverse Transkription (RT). Einfach gesagt eine Umwandlung von RNA in DNA, welche von einem Enzym namens Reverse Transkriptase katalysiert wird. Dadurch ist man mit RT-LAMP in der Lage RNA in einer Probe zu detektieren, obwohl man eigentlich DNA amplifiziert um das Ergebnis zu erhalten.

Wie weiß man, ob eine Reaktion positiv ist?

Wie wir gerade gelernt haben ist RT-LAMP eine Reaktion, die zu DNA-Vervielfältigung führt, falls eine spezifische RNA-Sequenz in der Probe vorhanden ist. Aber wie kann man beurteilen, ob diese Reaktion überhaupt stattgefunden hat? LAMP führt zu einer so massiven Vervielfältigung von DNA, dass diese die chemische Balance der Reaktionslösung durch die Bildung bestimmter Nebenprodukte rapide verändert. Die Veränderung der Menge dieser Nebenprodukte führt zum Farbumschlag bestimmter Farbstoffe, die wir daher als Indikatoren für den erfolgreichen Reaktionsablauf nutzen und die Reaktion mit bloßem Auge verfolgen können!

virale RNA
violetter Reaktionsmix
blaues positives Ergebnis
SARS-CoV-2 nachgewiesen
virale RNA
violetter Reaktionsmix
violettes negatives Ergebnis
kein SARS-CoV-2 nachgewiesen

Unsere LAMPs im Porträt

Zwei verschiedene Reaktionstypen

RT-LAMP

Den Reaktionsmix zusammenstellen, die inaktivierte Probe zugeben, für 30 Minuten bei 63°C inkubieren. Einfach, schnell, günstig.

RT-LAMP

Innerhalb von 40 Minuten von der Probennahme zum Ergebnis. Minimale Bearbeitungszeit im Labor. Sichere Diagnosestellung bei allen Proben von infektiösen Personen. Farbumschlag von Violett nach Blau.

bead-LAMP

Die Proben-RNA aufreinigen und -konzentrieren mittels magentischer Partikel ("Beads"), dann die LAMP-Reaktion starten. Überlegene Sensitivität.

bead-LAMP

Innerhalb von 50 Minuten von der Probennahme zum Ergebnis. Beinhaltet einen 15-minütigen Bead-Aufreinigungsschritt zur Konzentration der viralen RNA. Identifiziert positive Proben sogar bei sehr geringer enthaltener Virusmenge. Farbumschlag von Rot nach Gelb.

Massiver Sensitivitätsgewinn durch bead-LAMP

Ein schneller, einfacher und relativ günstiger Konzentrationsschritt mit magnetischen Beads erlaubt es, ein Vielfaches des herkömmlichen Probenvolumens in der Reaktion einzusetzen. Dadurch kann die LAMP-Reaktion selbst schwach positive Proben identifizieren, die mit gewöhnlichen LAMP- oder Antigenschnelltests nicht nachweisbar wären. Bead-LAMP erreicht somit den Sensitivitätsbereich der Goldstandard-PCR-Tests.  

Einsatz verschiedener Probenmedien möglich

Manche RT-LAMP-Reaktionen funktionieren nur mit extrahierter RNA – unser LAMP kann mehr. Die Methode ist kompatibel mit vielen verschiedenen Probentypen und kommt ohne RNA-Extraktion aus. Unsere Protokolle funktionieren mit Abstrichproben (in vielen gängigen Probenaufnahmemedien), mit Spucke und Gurgelat. Gurgeln bietet dabei die optimale Kombination aus Einfachheit und Komfort in der Anwendung bei gleichzeitiger ausreichender Sicherheit und Sensitivität. Nach Entnahme werden die Proben durch eine sehr kurze Inkubation bei 95°C in Anwesenheit einer speziellen Pufferlösung inaktiviert. Das Virus wird hierbei zerstört, aber die virale RNA wird erhalten. Dabei sollte beachtet werden, dass direkt inaktivierende Transportmedien grundsätzlich mit RT-LAMP inkompatibel sind, weil enthaltene aggressive Chemikalien die Reaktion inhibieren. 

Eindeutiger Farbumschlag

Unsere Protokolle basieren auf dem visuellen Nachweis zweier verschiedener Nebenprodukte der DNA-Amplifikation. Für RT-LAMP nutzen wir den Indikatorfarbstoff Hydroxynaphtholblau, der durch ein Absinken der Konzentration an freiem Magnesium einen Farbumschlag von Violett nach Himmelblau erfährt. Für bead-LAMP verwenden wir Phenolrot, einen pH-abhängigen Farbstoff, dessen Farbumschlag von Rot nach Gelb durch ein Absinken des pH-Werts durch die DNA-Amplifikation verursacht wird. Diesen Farbstoff können bei herkömmlichem RT-LAMP nicht benutzen, das die Reaktion dadurch mit einigen Probenmedien inkompatibel sein würde. Bei bead-LAMP hingegen sorgt der Bead-Aufreinigungsschritt dafür, dass wir pH-modifizierende Probenmedien entfernen, und können Phenolrot somit verwenden.

Hochgradig sensitiv und spezifisch

Unsere RT-LAMP-Reaktionen sind für minimale Falschpositivrate und maximale Sensitivität optimiert. Weitere Informationen zu Sensitivität und Spezifität können in unserem <a href=“https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.23.166397v2″>bioRxiv-Manuskript</a> gefunden werden.

Open-Access-Konzept schützt RT-LAMP vor Lieferengpässen

Ein perfekter Test ist völlig nutzlos, wenn er nicht im großen Stil eingesetzt werden kann. Darum spielt die Verfügbarkeit der einzelnen Komponenten eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung unserer LAMP-Assays. Unsere Protokolle sind öffentlich zugänglich und werden auf unserer Website ständig aktualisiert, und wir haben Open-Access-Protokolle auf Basis der Wildtypenzyme BstLF und HIV-RT, die nicht durch Patente geschützt werden, entwickelt. So können die Enzyme weltweit genutzt werden, ohne das eine Erlaubnis eingeholt oder Lizenzgebühren gezahlt werden müssen. Nur so können etwaige Lieferengpässe vermieden werden, die seit Beginn der Pandemie Massentestungen erschwert haben. Alles ist öffentlich und jedermann kann es herstellen – Versorgungslücken adé!

Unsere Protokolle im Überblick

Wir stellen Protokolle für RT-LAMP und bead-LAMP zur Verfügung. Jeder Nutzer kann entscheiden, ob er den Großteil der Reagenzien und Enzyme kaufen möchte, oder Enzyme und/oder Puffer selbst herstellen möchte. Für beide Varianten bieten wir auf dieser Seite Protokolle an.

KOMMERZIELLE PROTOKOLLE

  • nutzen im Handel erhältliche Reagenzien
  • geringster initialer Aufwand 
  • qualitätsgeprüfte Produktchargen
  • höherer Preis pro Reaktion
  • anfälliger für Versorgungsengpässe

Open-Access-Protokolle

  • nutzen selbst exprimierte/aufgereinigte Enzyme
  • mehr initialer Aufwand
  • Chargen müssen selbst getestet werden
  • sehr geringer Preis pro Reaktion
  • nicht anfällig für Versorgungsengpässe

Günstig

Ein Test zum Preis einer Tasse Kaffee

Weniger als ein Euro pro RT-LAMP-Reaktion. Dieser niedrige Preis ermöglicht flächendeckendes, schnelles Testen überall auf der Welt.

Visuell

Visuelles Auslesen mittels Farbumschlag

Ein einfacher, mit bloßem Auge sichtbarer Farbumschlag zeigt die Anwesenheit von SARS-CoV-2-Molekülen an.

Einfach

Low-Tech-Protokoll

Virusnachweis ohne RNA-Extraktion, Thermocycler oder Fluoreszenz: RT-LAMP läuft bei konstant 63°C in Inkubatoren, Thermoblocks oder sogar Wasserbädern!

Schnell

Von der Probennahme zum Ergebnis in unter 40 Minuten

Virusnachweis ohne RNA-Extraktion, Thermocycler oder Fluoreszenz: RT-LAMP läuft bei konstant 63°C in Inkubatoren, Thermoblocks oder sogar Wasserbädern!

Open Access

Technologien für jedermann

Wie wollten einen Test entwickeln, den jeder durchführen kann. Unsere Open-Access-Protokolle und -Enzyme kann jedes molekularbiologische Labor kostengünstig selbst nutzen und herstellen und umgeht damit Großhändler, das Resultat: unglaublich geringe Kosten pro Reaktion. Pufferzusammensetzungen sind öffentlich und nicht geschützt. 

Selbstständiges Testen

Einfache, bequeme Probennahme

Gurgeln ist eine effektive, komfortable und verlässliche Probennahmemethode für SARS-CoV-2-Tests. Der Arbeitsaufwand für medizinisches Personal wird außerdem gesenkt, indem diese eigenständig durchführbare Methode der Probennahme gewählt wird.

Skalierbarkeit

kompatibel mit Hochdurchsatz und gleichzeitig flexibel

RT-LAMP kann zu Hause mit einer Handvoll Laborplastik und Pipetten, oder in klinischem Hochdurchsatzumfeld mit automatisierten Abläufen durchgeführt werden. Skalierbarkeit ist ein kritischer Punkt, wenn man einen Unterschied machen will. Unsere Methode kann einfach automatisiert und hochskaliert werden, um im hochtechnisierten Klinikalltag zu bestehen.

Flexibilität

Mit verschiedenen Probentypen kompatibel

Egal ob Abstrichproben in Viral Transport Medium/Universal Transport Medium/Kochsalzlösung oder Gurgelat in HBSS/Kochsalzlösung/Wasser, RT-LAMP und vor allem bead-LAMP sind mit vielen verschiedenen Probenmedien kompatibel.

Sicher

Prävention von Kreuzkontamination

LAMP ist grundsätzlich recht anfällig für Kontamination. Wir haben ein bereits bekanntes System zur Kontaminationsprävention, basierend auf dUTPs und thermolabilem UDG-Enzym, implementiert. Damit wird sichergestellt, dass die Falschpositivrate und der Arbeitsaufwand im Labor minimal gehalten werden.

LAMP vs PCR vs Antigentest

Um einer schweren Pandemie zu begegnen, braucht es diverse Ansätze. Wir behaupten nicht, dass LAMP in allen Szenarien am besten ist, und um die Verbreitung des Virus zu stoppen ist sicherlich eine komplexe Strategie mit allen gängigen Testmethoden nötig. Hier präsentieren wir eine übersichtliche Aufstellung dieser verschiedenen Technologien, wie sie funktionieren und was sie unterscheidet.

PCR Testergebnis

PCR

Was nachgewiesen wird

Virale RNA

Wie es funktioniert

DNA-Amplifikation wird in Echtzeit mittels Fluoreszenz visualisiert.

Wo es angewendet wird

Diagnostische Labore

Sensitivität

Sehr hoch

Kosten

Hoch

Probentyp

Bevorzugt Abstrichproben oder extrahierte RNA

Bearbeitungszeit

2-4 Stunden

RT-LAMP color readout

LAMP

Was nachgewiesen wird

Virale RNA

WIe es funktioniert

DNA-Amplifikation wird durch Farbumschlag der Reaktionslösung angezeigt.

Wo es angewendet wird

Diagnostische Labore, Arztpraxen, zu Hause

Sensitivität

Mittel bis hoch

Kosten

Niedrig

Probentyp

Gurgelat, Abstriche, Spucke, keine RNA-Extraktion notwendig

Bearbeitungszeit

30-45 Minuten

Antigen Test Quelle: Medakit Ltf

Antigentest

Was nachgewiesen wird

Oberflächenproteine der Viruspartikel

WIe es funktioniert

Die Bindung eines Antikörpers an ein Oberflächenprotein auf der Virushülle wird auf einem Teststreifen (Lateral Flow Strip) visualisiert.

Wo es angewendet wird

Diagnostische Labore, Arztpraxen, zu Hause.

Sensitivität

Niedrig bis mittel

Kosten

Niedrig bis mittel

Probentyp

Abstrichprobe

Bearbeitungszeit

5-30 Minuten