Häufige Fragen

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Sie möchten RT-LAMP praktisch nutzen, benötigen aber noch etwas Hintergrundwissen? Dann sind Sie hier genau richtig. Dies ist eine zusammenfassende Übersicht der Fragen, die uns immer wieder gestellt wurden: eine erste Anlaufstelle, wenn Ihnen etwas an LAMP noch unklar ist. Wenn Ihnen immer noch etwas fehlt, wenden Sie sich gerne an uns unter info@rtlamp.org oder über das Kontaktformular am Ende dieser Seite.

Generelle Fragen

  • Warum verwendet ihr DNA QuickExtract für die Inaktivierung der Proben? Wird dadurch nicht die DNA isoliert?
  • Wir haben festgestellt dass sich DNA QuickExtract hervorragend dazu eignet, RNA aus Viruspartikeln und infizierten Zellen zu isolieren und dabei vor den in der Probe enthaltenen RNAsen zu schützen. Also ja, DNA QuickExtract ist hierfür ein passendes und einfach erhältliches Reagenz.
  • Muss ich die Reaktionen auf Eis zusammenstellen?
  • Das Arbeiten auf Eis ist notwendig, wenn Sie die mit den open-access-Protokollen hergestellten Enzyme ohne warmstart-Eigenschaften nutzen. Für die Nutzung der WarmStart LAMP Reagenzien von NEB wird Arbeiten auf Eis empfohlen, da es dabei hilft, unspezifische Amplifikation zu verhindern und die Qualität der Proben zu erhalten.
  • Die Komponenten für LAMP selbst einzeln einzukaufen erscheint mir ziemlich stressig, kann ich nicht alles aus einer Hand kaufen?
  • Momentan leider nicht, wir arbeiten aber gerade an einem solchen Kit. Falls Sie an einem solchen Produkt interessiert wären, lassen Sie uns die gewünschte Stückzahl wissen, damit wir unsere Produktion entsprechend anpassen können.
  • Muss ich für die Nutzung dieser Protokolle Lizenzgebühren bezahlen??
  • Nein. Wir wollen jedem den Zugang zu sensitivem, schnellem, günstigem und häufigem Testen ermöglichen, und stellen unsere Protokolle daher kostenlos zur Verfügung. Jedoch sollte jeder Nutzer die Protokolle zuerst im eigenen (Labor-)Umfeld validieren, wir können keine Erfolgsgarantie aussprechen.
  • Erhöhe ich die Sensitivität meiner RT-LAMP-Reaktion, wenn ich Sie länger als empfohlen inkubiere?
  • Auf keinen Fall sollten die Reaktionen für mehr als 35 Minuten inkubiert werden. Wir haben die Reaktionsbedingungen optimal eingestellt, längere Inkubationszeiten führen häufig zum Auftreten von falsch positiven Ergebnissen.
  • LAMP-Reaktionsgefäße sollten niemals geöffnet werden. Warum?
  • Ähnlich wie eine PCR vervielfältigt LAMP im Reaktionsverlauf DNA. Im Gegensatz zur PCR, bei der die Menge an DNA pro Reaktionszyklus nur verdoppelt wird, ist die Amplifikation bei LAMP jedoch viel massiver. Dadurch ist die Gesamtmenge an Produkt-DNA viel größer als bei einer PCR. Beim Öffnen könnten daher Aerosole oder Tröpfchen die Arbeitsflächen mit Produkt-DNA kontaminieren (es handelt sich hier aber nicht um infektiöses Material). In einer so kontaminierten Umgebung können in der Folge falsch positive Ergebnisse auftreten. Dieses Risiko wird zwar in unseren Protokollen durch das dUTP/UDG-System minimiert, trotzdem kann man durch das Nicht-Öffnen eine mögliche Fehlerquelle vermeiden. Kontaminierte Arbeitsmaterialien und -bereiche müssen mit 5-10% Bleichmittellösung gereinigt werden.
  • Warum habt ihr eure Protokolle mit festgeschriebenen kommerziellen Reagenzien entwickelt? Bewerbt ihr diese Reagenzien, oder habt Absprachen mit den Herstellern getroffen?
  • Die in unseren Protokollen genutzten Produkte haben hervorragende Ergebnisse in unseren RT-LAMP-Experimenten erzielt. Wir empfehlen diese Reagenzien für RT-LAMP-Anwender, da sie das Aufsetzen der Reaktionen einfach machen und einer strengen Qualitätssicherung unterliegen. Wir stehen in keinerlei geschäftlichem Verhältnis mit den Herstellern dieser Produkte.
  • Ist RT-LAMP eine in der Klinik akzeptierte diagnostische Methode?
  • Das hängt von der jeweiligen Rechtslage vor Ort ab. LAMP ist nicht neu, aber generell keine etablierte diagnostische Methode. Erkundigen Sie sich bei Ihrer lokalen Gesundheitsbehörde. Falls Sie ein diagnostisches Labor betreiben, könnten Sie mit einer internen Validierung unserer RT-LAMP-Protokolle beginnen. Sie können auch selbst mit lokalen Gesetzgebern und gesundheitspolitischen Vertretern in Verbindung treten, um die offizielle Anerkennung von RT-LAMP als Hilfsmittel in der Pandemiebekämpfung voranzutreiben.

RT-LAMP

  • Welche Probentypen sind mit RT-LAMP kompatibel?
  • RT-LAMP ist mit einer Reihe von Standard-Probenmedien für Gurgel- und Abstrichproben kompatibel. Wir haben HBSS, 0,9% Kochsalzlösung und VTM als Probenmedien umfassend getestet. Die meisten üblichen RT-LAMP-Protokolle sind entweder nur mit einem Probentyp kompatibel, oder funktionieren sogar nur mit extrahierter RNA in nukleasefreiem Wasser. Weitere Informationen zum Thema Probenkompatibilität finden Sie in unserem Preprint (Kellner et al., 2020, bioRxiv).
  • Der Farbumschlag bei RT-LAMP ist für mich sehr schwer zu erkennen. Kann ich nicht einfach den colorimetrischen Kit für bead-LAMP benutzen?
  • Das Problem liegt in der Natur des colorimetrischen Kits, dessen Farbumschlag auf der Veränderung des pH-Werts während der DNA-Amplifikation beruht. Da aber verschiedene Probenmedien unterschiedliche Ausgangswerte für den pH besitzen, können sie zu falsch positiven oder falsch negativen Resultaten führen, wenn man sie zum colorimetrischen LAMP Kit- Reaktionsmix zugibt. Der von uns entwickelte RT-LAMP-Assay nutzt die Konzentration an freiem Magnesium in der Reaktion für den Farbumschlag und umgeht damit dieses Problem. Wenn Sie Probleme haben, den Farbumschlag zu erkennen, oder an einer Farbenblindheit leiden, können sie zur erleichterten Visualisierung der Farbunterschiede die Web-App colorimetry.net nutzen.
  • Brauche ich Filterspitzen für meine Pipetten, oder genügen gewöhnliche?
  • Uns ist bekannt, dass es zu Engpässen bei der Versorgung mit Filterspitzen kommen könnte. Derzeit werden sie routinemäßig für manuelle und automatisierte Covid-19-Diagnostik eingesetzt. Der Gebrauch von Filterspitzen dient der Kontaminationsprävention. Striktes Einhalten aller weiteren Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen sollte aber die Nutzung von ungefilterten Spitzen ermöglichen. Diese Entscheidung muss jeder Nutzer letztendlich selbst treffen.
  • Kann ich mehr Probenmaterial zur RT-LAMP-Reaktion zugeben?
  • Wir haben den Probenanteil unseres Reaktionsvolumens optimiert (ein Fünftel). Sie können das Gesamtvolumen auf. 20, 30 oder sogar 50 Mikroliter erhöhen, aber der prozentuale Anteil der Komponenten muss gleich bleiben um korrekte Ergebnisse zu gewährleisten.
  • Die Farbe meiner RT-LAMP-Reaktion hat sich bereits bei Probenzugabe, noch vor der Inkubation, geändert. Was soll ich tun?
  • Wahrscheinlich enthielt das Probennahme-Medium eine chemische Komponente, die den Farbumschlag von HNB inhibiert. Dies sind meist eine chaotrope Verbindungen wie etwa Guanidiniumsalze, oder Metallchelatoren wie EDTA. Diese Probe ist somit inkompatibel mit RT-LAMP und muss entweder mit beadLAMP gemessen werden, oder die Probe muss in einem anderen Medium aufgenommen werden, etwa 0,9% Kochsalzlösung.

bead-LAMP

  • Ich möchte mehrere Proben in einer Reaktion vereinen (“poolen") um die Gesamtzahl an Reaktionen zu reduzieren. Kann ich die einzelnen Proben vor der Inaktivierung poolen, um Inaktivierungslösung zu sparen?
  • Ja, vor oder nach Inaktivierung zu poolen ist möglich und gleichwertig. Wenn man vor der Inaktivierung poolt, müssen jedoch adäquate Schutzmaßnahmen eingehalten werden, da mit infektiösen Proben gearbeitet wird. Diese Herangehensweise hilft beim Haushalten mit Inaktivierungslösung, wenn aber ein Pool positiv getestet wird müssen die einzelnen Proben nochmals inaktiviert und getestet werden, um die positive Probe zu finden.
  • Wie viele Proben kann ich gleichzeitig poolen?
  • Das hängt von vielen Faktoren ab, wie etwa die gewünschte Sensitivität des Assays oder der Anteil an positiven Proben im Probensatz. Wir empfehlen, die einschlägige Literatur nach Pooling-Strategien für SARS-CoV-2 zu durchsuchen. Pooling-Strategien für PCR-Tests gelten in der Regel auch für bead-LAMP. Grundsätzlich empfehlen wir das Poolen von 10 Proben.
  • Meine Probe ist bereits Gelb geworden bevor ich sie in Inkubator/Thermocycler/Wasserbad gegeben habe, was ist passiert? Kann ich weitermachen?
  • Ein positives Ergebnis kann nie vor der Inkubation bei 63°C vorliegen, dies liegt höchstwahrscheinlich an Rückständen von Ethanol im Reaktionsgefäß, die bei Zugabe des bead-LAMP-Rekationsmixes noch vorhanden waren. Entfernen Sie daher nach dem Waschschritt das Ethanol vollständig, und lassen Sie die Beads 3-5 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Wenn Sie vor der Inkubation einen Farbumschlag beobachten, können Sie niemals weitermachen. Sie müssen von Vorne beginnen um verwertbare Ergebnisse zu erzielen.
  • Meine bead-LAMP-Reeaktion ist orange geworden, irgendetwas zwischen gelb und pink. Wie kann ich das interpretieren?
  • Alle nicht-gelben Ergebnisse sollten negativ gewertet werden. Wenn Sie unsicher sind, vergleichen Sie die Farbe mit der einer Positivkontrolle. Aus diesem Grund empfehlen wir, bei jeder Testreihe eine Positivkontrolle mitzuführen.

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